ELISA試劑盒操作的幾個(gè)關(guān)鍵性程序

1 標(biāo)本的采取和保留 
可用作elisa測(cè)定的標(biāo)本非常廣泛，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、大便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其間某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清、尿液)，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如大便和某些分泌物)。大多數(shù)ELISA檢查均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚富含纖維蛋白原和抗凝劑外，別的成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只需待血清天然凝結(jié)、血縮短后即可獲得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)查驗(yàn)中均以血清作為檢查標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等運(yùn)用。血清標(biāo)本可按慣例辦法收集，應(yīng)留意防止溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為符號(hào)的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本也許會(huì)添加非特異性顯色。


血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢查。如有細(xì)菌污染，菌體中也許富含內(nèi)源性HRP，也會(huì)發(fā)作假陽(yáng)性反響。如在冰箱中保留過(guò)久，其間的可發(fā)作聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。通常說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超越一星期測(cè)定的需低溫冰存。凍住血清融解后，蛋白質(zhì)有些濃縮，散布不均，應(yīng)充沛混勻宜輕緩，防止氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上激烈振動(dòng)?；鞚峄蛴谐练e的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，弄清后再檢查。重復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)下跌，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保留作屢次檢查，宜少量分裝冰存。保留血清自收集時(shí)就應(yīng)留意無(wú)菌操作，也可參加恰當(dāng)防腐劑。


2 試劑的預(yù)備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的請(qǐng)求預(yù)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA頂用的蒸餾水或去離子水，包含用于洗刷的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液運(yùn)用pH計(jì)丈量較正。從冰箱中取出的實(shí)驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后運(yùn)用。試劑盒中本次實(shí)驗(yàn)不需用的有些應(yīng)及時(shí)放回冰箱保留。


3 加樣 
在ELISA中通常有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行發(fā)作氣泡。 加標(biāo)本通常用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，避免發(fā)作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震動(dòng)器上震動(dòng)1分鐘以確保混和。加酶物運(yùn)用液和底物運(yùn)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程迅速完結(jié)。


4 保溫 
在ELISA中通常有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶物后?？乖贵w反響的完結(jié)需求有必定的溫度和時(shí)刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的只在固相表面上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有均等的和固相抗的時(shí)機(jī)，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個(gè)逐漸平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才干到達(dá)反響的結(jié)尾。在這以后參加的酶符號(hào)抗體與固相抗原的也相同如此。這即是為何ELISA反響老是需求必定時(shí)刻的溫育。


溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體的適宜溫度。在樹(shù)立ELISA辦法作反響動(dòng)力學(xué)研討時(shí)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)品的生成可達(dá)。為加快反響，可進(jìn)步反響的溫度，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中過(guò)夜，以形成zui多的沉積。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在ELISA中通常不予選用。