非放射性地高標(biāo)記DNA探針法

實驗原理

以往人們是用放射性同位素來標(biāo)記探針DNA。近年來，非同位素標(biāo)記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標(biāo)記法的趨勢。地高配基隨機標(biāo)記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標(biāo)記方法（Saiki等，1985）。其原理是：用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補DNA，化學(xué)修飾過的dUTP同時摻入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高單抗與標(biāo)記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的化合物?；蛴肵-film放射自顯影。 地高標(biāo)記DNA的基本過程是：制備DNA探針，標(biāo)記探針，檢測樣本。其中關(guān)鍵步驟是要得到高靈敏度、高特異性的探針。
標(biāo)記：采用隨機引物標(biāo)記方法，可標(biāo)記少至10ng，多至3ug的DNA。能在新合成的DNA鏈每20-25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應(yīng)時間約為1h。
雜交：按標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進行。可以采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復(fù)使用。
免疫學(xué)檢測：封阻后，檢測反應(yīng)的*步，抗體結(jié)合物與標(biāo)記DNA結(jié)合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標(biāo)記DNA，顯色反應(yīng)起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和硝基蘭四唑NBT，在幾分鐘內(nèi)便開始出現(xiàn)藍(lán)色，顯色反應(yīng)的過程持續(xù)3天。典型的例子是在24小時后終止顯色反應(yīng)。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。
應(yīng)用：地高配基標(biāo)記DNA探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源DNA，能檢測1µg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標(biāo)記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實驗結(jié)果（從DNA的標(biāo)記和雜交至見到檢測結(jié)果24h內(nèi)能完成），而且消除了放射性的不安全問題。試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術(shù)（包括DNA-印跡轉(zhuǎn)移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。

實驗試劑

1. DNA稀釋緩沖液有兩管，每管1ml：

  [成分為：Tris-HCl(10mM)，EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)]內(nèi)含鮭魚精DNA（50µg/ml）。

2. 六聚核苷酸混合物

3. 標(biāo)記用混合底物：此管內(nèi)有50µl，濃度的dNTP標(biāo)記用混合底物，含dATP（1mL）dCTP(1mM)，dGTP(1mM)，dTTP(0.65mM)和Dig- 
     dUTP(0.35mM)，pH6.5(20℃)。

4. DNA聚合酶Ⅰ大片段（標(biāo)記級）：此管內(nèi)有25µl，DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2 U/µl　。

5. （Dig）AP結(jié)合物：此管內(nèi)有200µl，多克隆羊抗地高配基Fab-片段，結(jié)合有堿性磷酸酶750 U/ml。

6. NBT有兩管，每管1.25ml，溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基藍(lán)四唑鹽溶液（75mg/ml）。

7. X-磷酸鹽，兩管，每管0.9ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

8. 封阻試劑，兩瓶，每瓶有50g粉劑。

需配制的溶液：

EDTA(0.2M),pH8.0(20℃)   
LiCl(4M)    
70%(V/V)乙醇
Tris-HCl(10mM) 
EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)  
10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽  
10%(V/V)SDS   
0.3M檸檬酸三鈉          
3M NaCl       
20×SSC
pH7.0,Tris-HCl(100mM)  
NaCl(150mM)  
pH7.5Tris–HCl(100mM)          
MgCl₂(50mM)pH9.5(20℃)  
NaCl(100mM)

實驗步驟

1. 取10µl待測DNA，于1.0％瓊脂糖凝膠上進行電泳。

2. 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號, 拍照, 記錄電泳結(jié)果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。

3. 雜交用膠的制備
   (1) 將凝膠浸沒入30mL 0.25M HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
   (2) 用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
   (3) 將凝膠浸沒入30mL　0.4M NaOH中30min, 使它被中和。

4. 準(zhǔn)備DNA從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的平臺
   (1) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉(zhuǎn)移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標(biāo)記。
   (2) 另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約18cm)足以達(dá)到轉(zhuǎn)移液盒子的底部。
   (3) 準(zhǔn)備10 X SSC 轉(zhuǎn)移液。
   (4) 將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉(zhuǎn)移液中。

5. 安裝毛細(xì)管轉(zhuǎn)移裝置
   (1) 將長的濾紙放在轉(zhuǎn)移平臺的頂部，濾紙兩端達(dá)到轉(zhuǎn)移盒的底部，做成虹吸橋。
   (2) 將8 0mL轉(zhuǎn)移液倒入轉(zhuǎn)移盒內(nèi)，并濕潤濾紙。
   (3) 將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
   (4) 用保鮮紙封住凝膠四邊。
   (5) 將浸濕的轉(zhuǎn)移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
   (6) 將剩下的3張濾紙小心的放在轉(zhuǎn)移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一玻璃板，其上壓一重物。
   (7) 轉(zhuǎn)移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉(zhuǎn)移液干枯。

6. 已轉(zhuǎn)移的DNA與膜交聯(lián)
   (1) 將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
   (2) 將膜置于UV 交聯(lián)器（crosslinker）中，在紫外光下自動交聯(lián)3min。
   (3) 用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜，空氣中干燥。
此膜可在4℃長期保存。

7. 標(biāo)記DNA探針　每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3ug線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

   (1) DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

   (2) 取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上,加下列及試劑：

　　新鮮變性的DNA 　　　　　　　　　  1-3µg

　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　   2µl　

　　dNTP標(biāo)記用混合底物 　　　　　　　 2µl　

　　加無菌重蒸水至　　　　　　　　　   19µl　

　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow 5U/ul）1µl　

   (3) 在37℃保溫至少60min，可到20h。

   (4) 煮沸5min，終止反應(yīng)。

   (5) 15000rpm離心30s，置于冰上待用。

8. 預(yù)雜交　按100cm²膜用20-40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時使溶液處于流動狀態(tài)。

　　預(yù)雜交液組成：5×SSC

　　0.5%（W/V）封閉試劑：1%聚蔗糖（Ficool 400），1%PVP，1%BSA。

　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

　　0.02%（W/V）SDS

　　膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過夜。

9. 雜交　按100cm²膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。

　　雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）

　　                         5%（W/V）封閉試劑

　　                         5×SSC

　　                         0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉

　　                        0.02%(W/V)SDS

　　                        新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml）

雜交液取代預(yù)雜交液，替換時膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。

10. 洗膜　　按100cm²膜用250ml洗膜液計算。

   (1) 在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

   (2) 在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

   (3) 在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

11. 免疫測定

   (1) 配制溶液

　　緩沖液1：Tris-HCl(100mM);NaCl(150mM)pH7.5(20℃）

　　緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。

　　緩沖液3：Tris-HCI(100mM);NaCI(100mM);MgCI2(500mM)pH9.5(20℃)。

　　緩沖液4：Tris-HCl(10mM);EDTA(1mM);pH8.0(20℃)

　　顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45µl　NBT溶液（管9）和35µl　 X-磷酸鹽緩沖液。

  (2) 顯色過程

　     A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。

　     B．在100ml緩沖2中保溫30min。

　     C．再用緩沖液1短暫洗滌。

　     D. 用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。

　     E. 膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。

　     F. 用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。

　     G. 膜在緩沖液3中平衡2min。

      H. 在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯現(xiàn)時，不可振蕩或攪拌。

　     I．當(dāng)要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。

      J．?dāng)z相。

說明：上述各反應(yīng)均在室溫下進行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。

注意事項

1. DNA不能有效地被標(biāo)記時考慮

   (1) 用酚/抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。

   (2) 標(biāo)記反應(yīng)的保溫時間延長（增至20h）。

   (3) DNA變性或許不*，這時對大片段DNA特別重要。

2. 不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時考慮

   (1) DNA標(biāo)記率。

   (2) 增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時間。

   (3) 顯色反應(yīng)的時間可延長至3天。

3. 若顯色時背景過深，可采取

   (1) 在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。

   (2) 增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。

   (3) 某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。

   (4) 在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。